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L'effet de PM2,5 au niveau de l'autophagie des kératinocytes humains

05/31/2019

  1. L'introduction de PM2,5

Dans le processus du métabolisme cellulaire, il existe la synthèse et la dégradation des protéines et d'autres macromolécules, ainsi que la mise à jour des organites. Il y a deux façons de dégrader les substances dans les cellules: les chercheurs du protéasome et autophagy.Some ont proposé que l'autophagie est la réponse au stress de base des cellules pour assurer leur survie dans des conditions difficiles, et il peut être utilisé comme un mécanisme de protection des cellules à adapter à l'environnement, prévenir ou atténuer l'apparition de dommages.

PM2,5 PM dont le diamètre aérodynamique est inférieur à 2.5 microns. Maintenant, un grand nombre d'études ont montré que PM2,5 peut induire l'autophagie dans les macrophages alvéolaires et vasculaire endothéliale cells.In cette étude, l'expression de marqueurs biologiques liés à autophagie a été observée par traitement de kératinocytes humains avec différentes concentrations de P2,5 et des composants, et le mécanisme possible de l'induction de l'autophagie a été étudiée.

 

2.Les matériaux de test d'impact de la peau et des méthodes de PM2.5

2.1Matériaux et réactifs

lignée cellulaire épidermique humain immorphic Ha Ca T a été acheté du centre de la Chine pour la préservation des cultures typiques (Université wuhan).emplacement PM2.5: 6 mètres au-dessus du sol, sur le toit de l'Institut de recherche atmosphérique, École de l'environnement, Université de Géosciences Chine (wuhan).Le travail de collecte spécifique a été réalisée avec l'aide de l'école de l'environnement, Université de Géosciences Chine (wuhan).protéine apparentée microtubules 1 chaîne légère 3(LC3) un anticorps de lapin polyclonal anti-humain (La signalisation cellulaire, Etats-Unis), souris anti-bêta-actine (wuhan Baode co génie biologique., LTD.), kit de dosage de protéine BCA de concentration, inhibiteur de la protéase et de lysat RIPA (L'Institut de la biotechnologie jiangsu);immunofluorescence: chèvre anti-Ig de lapin G, chèvre HRP anti-lapin marqué anticorps secondaire (wuhan génie biologique co de bon augure., LTD.), microscope à fluorescence BX53 (Olympe, Japon).

2.2Préparation et regroupement de venin contaminé

Un certain poids de poudre P2,5 a été pesé et ajouté à 0.9% une solution saline normale pour préparer la liqueur mère à une concentration de 1000 mu g / ml, qui a été complètement mélangés et centrifugés à 13000g / min 30 moi. Le surnageant a été pris comme solution de réserve de composants solubles dans l'eau P2,5 à une concentration de 1000 mu /mL.By la même méthode, Le sédiment a été pris comme solution de réserve de P2,5 composants insolubles avec une concentration de 1000 Tasse concentrations /mL.The prédéfinie du venin de colorant sont :0.1 micron / mL, 1 micron / mL, 10 micron / mL et 100 micron cellules /mL.The contaminées par le venin ont été divisés en deux groupes: groupe A (les composants solubles dans l'eau de P2,5) et le groupe B (les composants solubles dans l'eau de P2,5).Selon la concentration, ils ont été divisés en groupe A1 (0.1 tasse / ml), groupe A2 (1 tasse / ml), groupe A3 (10 tasse / ml), groupe A4 (100 tasse / ml), groupe B1 (0.1 tasse / ml), groupe B2 (1 tasse / ml), groupe B3 (10 tasse / ml) et le groupe B4 (100 tasse / ml).

2.3La culture cellulaire et le regroupement

Ha Ca cellules T ont été classiquement cultivées dans du milieu DMEM riche en sucre contenant 10% de sérum bovin fœtal, 37℃, 5% CO2, et incubateur de cellules avec une humidité saturée par rapport. La solution a été modifiée pour 2 ~ fois 3d, et la culture de passage classique a été effectuée. cellules logarithmiques avec bon état de croissance ont été sélectionnés pour le experiment.In le groupe expérimental, Ha Ca cellules T avec une bonne croissance ont été respectivement traités avec différentes concentrations de P2,5 dans le groupe A et le groupe B et incubées dans un incubateur à 37 ℃ stérile pour 24h.Meanwhile, un groupe de contrôle à blanc a été mis en place.

2.4L'expression de LC3 a été détectée par immunofluorescence

Les cellules des groupes expérimentaux ci-dessus ont été prélevés, et les lames avec de bonnes cellules d'escalade ont été trempés et lavés dans du PBS pour 3 fois dans la plaque de culture, 3min à chaque fois, fixe avec 4% paraformaldéhyde, et ensuite à température ambiante pendant 15min.PBS contenant 0.5% Triton X-100 a été ajouté et imprégné à la température ambiante pendant 20min.After trois fois de PBS et immersion à laver, ils ont été sucé, et du sérum de chèvre normal a été ajouté sur la lame de verre, étanche à la température ambiante pour la solution de 30min.The a été absorbée par le papier absorbant sans lavage. Chaque lame de verre a été ajouté avec un anticorps primaire dilué suffisamment LC3(1:500) et placés dans une boîte humide, on incube à 4 ℃ anticorps primaire overnight.Remove, rincer avec du PBS pendant 5 min, répéter 3 Ig G anticorps secondaire anti-lapin times.Goat (1:100) a été mis en incubation à température ambiante pendant la 1h.Remove anticorps secondaire, rincer avec du PBS pendant 3min, et répétez 3 solution times.DAPI (1:400) a été souillé, incubée à température ambiante sous obscurité pendant 5 minutes, on le rince avec du PBS pendant 5 min, répété pour 4 fois, et retiré.Procédé fermé plaques à orifices de PBS ont été placées dans un microscope inversé à fluorescence Olympus BX53 dans le laboratoire pour prendre des photos et d'imagerie et d'observer les résultats expérimentaux.

2.5Western Blot a été utilisé pour détecter LC3-ii / I changements

Prenez les cellules expérimentales ci-dessus, 4 ℃ prérefroidissement, PBS rincée trois fois, ajoutant quantité appropriée de la solution de cellules (RIPA) et les inhibiteurs de la protéase (PMSF), la proportion selon la configuration, 1:100 fissure par ultrasons sur de la glace pour 30 moi, appris que déplacé à 1.5 mL tube de centrifugeuse de fluide surnageant, le kit BCA pour déterminer la concentration en protéines, SDS-PAGE séparation par électrophorèse, transféré sur une membrane de nitrocellulose, fermé 2 h à la température ambiante, la résistance à LC3 (1:1000) et actine bêta (1:200) 4 ℃ pendant une nuit d'incubation, deux étiquetage de résistance HRP (1:50 000) à température ambiante 2 h d'incubation,finalement, le film de PVDF a été balayée par l'expérience ECL chemiluminescence.Each a été répétée trois times.The expression de la bêta-actine a été utilisée comme référence interne, et la valeur d'échelle de gris du film a été analysé par la bande de numérisation.

2.6traitement statistique

Toutes les données ont été analysées avec le logiciel statistique SPSS20.0. Les données de mesure dans cette étude ont été exprimés en moyenne écart-type (x ± s). T-test a été utilisé pour la comparaison de la moyenne entre les deux échantillons, tandis que l'analyse à sens unique de la variance a été utilisée pour la comparaison de la moyenne entre plusieurs échantillons.

 

3.Les résultats des tests d'impact de la peau de PM2.5

3.1Les résultats de la coloration d'immunofluorescence ont été montrées dans la figure 1

Dans le groupe témoin, LC3 montré très faible et peu d'expression, tandis que les cellules du groupe expérimental traité avec 0.1, 1.0, 10.0 et P2,5 des concentrations et des composants différents a montré une expression positive positive ou même après coloration forte fluorescence, et l'intensité de fluorescence rouge augmente avec l'augmentation de la concentration de venin, et le niveau de l'autophagie a augmenté significantly.At la même concentration, il n'y avait pas de différence statistiquement significative de l'intensité de la fluorescence rouge entre les groupes A et B.

3.2Les résultats de Western Blot ont été présentés dans le tableau 1 et la figure 2 et 3

Après 24 heures de cellules d'intervention PM2.5, les niveaux d'expression de protéine LC3-II dans le groupe A1 ~ A4 et B2 ~ groupe B4 a augmenté avec l'augmentation de la concentration de P2,5, et étaient significativement plus élevés que ceux du groupe de contrôle (t = 5,38, 11.06, 23.07, 11.84 dans le groupe A, 2.77, 4.24, 8.83, 14.88 dans le groupe B).P < 0.05);Groupe B1 était également plus élevé que le groupe témoin, mais la différence n'a pas été statistiquement significative (t = 2,77, P = 0.05).A la même concentration, le niveau d'expression protéique de groupe A1 est plus élevé que celui du groupe B1 (F = 0.42, P > 0.05).Le niveau d'expression de protéine de groupe A2 est plus élevée que celle du groupe B2 (F = 1,85, P > 0.05).Le niveau d'expression des protéines du groupe A3 était supérieur à celui du groupe B3 (F = 3.96, P > 0.05).Le niveau d'expression des protéines du groupe A4 était supérieur à celui du groupe B4 (F = 5,19, P > 0.05).

 

4.La discussion de test d'impact sur la peau de PM2,5

L'autophagie est une voie de dégradation des protéines dans les cellules conservées, qui se réfère au procédé dans lequel la membrane d'isolement enveloppe cytoplasme et / ou organites pour former autophagosomes, puis fusibles avec les lysosomes pour former autophagosomes et se dégrade en présence de them.Its est médiée par un groupe de autophagie-relatedproteins (atg), dans lequel Beclin 1, beta LC3 (ou bêta-ii LC3) et P62 taux de protéines sont des indicateurs représentatifs de l'autophagie occurrence et les cellules intensity.When sont dans des conditions de stress telles que la famine, carence nutritionnelle, hypoxie, reconstruction structurelle au cours du développement des cellules et des dommages organite, niveau autophagie sera increase.Studies ont montré que l'autophagie peut non seulement promouvoir la santé du corps, mais a aussi une relation étroite avec des tumeurs, maladies infectieuses, maladies pulmonaires, les maladies neurodégénératives, cardiomyopathie, le vieillissement et les maladies séniles.

Figure. 1 immunofluorescence LC3 ( × 400)

Languette. 1 Les résultats de Western Blot de LC3Ⅱ / Ⅰ chaque groupe ( x ± s)

Un nombre important d'études ont montré que PM2,5 peut avoir des effets toxiques sur les voies respiratoires humaines, cardiovasculaire, endocrinien et d'autres systems.As le plus grand organe du corps humain, la peau est directement exposée à la surface du corps et en contact avec les polluants atmosphériques, qui est un important organe cible pour les effets des substances toxiques exogènes. toutefois, il y a peu d'études sur les effets de PM2,5 sur la peau toxicity.Magnani et al. étudié l'interaction entre le CAP et l'ultrastructure des tissus de la peau avec un microscope électronique à transmission. Après 24h de 100mg CAPS / mL intervention, PACs ont été observés à apparaître dans la couche supérieure de l'épiderme humain recon CONSTRUIT (L'un de Hri), puis est apparu dans les cellules plus profondes 48h plus tard, démontrant que PM2,5 peut être absorbé directement par le skin.So, lorsque les kératinocytes de l'épiderme humain sont exposées à l'environnement PM2,5, il va provoquer l'apparition de l'autophagie épidermique?Si c'est le cas, quels sont les effets des changements des niveaux de autophagie sur kératinocytes humains et quels mécanismes peuvent se produire?Pour résoudre ces problèmes, Cette étude a utilisé immunofluorescence et de la technologie de détection par transfert-ouest ern d'analyser qualitativement les changements du nombre de autophagosomes dans kératinocytes épidermiques humaines, et d'analyser quantitativement les changements dans l'expression de la protéine liée autophagie LC3.

Maintenant, il existe de nombreuses méthodes pour détecter autophagie, parmi lesquels LC3(la protéine apparentée à microtubule-l chaîne légère 3) est la protéine marqueur pour la détection d'autophagie. Le poids moléculaire du LC3-i est 18kD, distribué dans le cytoplasm.The poids moléculaire de LC3-II est 16kD. Lorsque l'autophagie se produit, autophagosome augmentation de la formation, LC3-i est coupé spécifiquement dans LC3-ii et transféré à autophagosome.Therefore, la conversion de LC3-i-ii à LC3 peut généralement être détectée afin de déterminer la survenue d'autophagy.Through analyse qualitative de coloration par immunofluorescence, il a été constaté que la protéine LC3 dans le groupe témoin a montré très faible et peu d'expression, tandis que les cellules du groupe expérimental induit par P2,5 ont montré une expression positive positive ou même après coloration forte fluorescence, et a montré une augmentation de la concentration auteur dependence.The en outre procédé à une analyse quantitative par la méthode de Western blot et a constaté que le LC3-II / I ratio de la protéine dans le groupe de a1-a4 et B2 ~ groupe B4 a augmenté avec l'augmentation de la concentration de P2,5, et était significativement plus élevée que dans le groupe témoin (P < 0.05).A la même concentration, il n'y a pas de différence significative dans l'intensité de l'action des composants solubles dans l'eau P2,5 et les résultats expérimentaux components.These insolubles dans l'eau, non seulement confirment que P2,5 peut induire l'autophagie dans les kératinocytes épidermiques humains, le maintien de l'homéostasie de l'environnement intracellulaire en décomposant ses propres protéines et organites, mais aussi de renforcer l'activité de l'autophagie des kératinocytes humains par l'augmentation de son concentration.Compared avec le groupe témoin, le niveau de protéine LC3-II dans le groupe B1 n'a pas été statistiquement significative, mais l'expression a été légèrement augmenté, suggérant autophagie dans les kératinocytes après PM2,5 induction.At en même temps, nous avons observé à travers un microscope à fluorescence que le nombre de cellules dans le groupe expérimental a été significativement réduite après le traitement du venin de PM2,5 à la concentration maximale (100 tasse / ml), avec membrane cellulaire incomplète accompagnée par la fragmentation nucléaire, état de la cellule pauvre et la tendance des cellules à apoptosis.This est similaire à des caractéristiques des autophagie des kératinocytes humains irradiés par UV observée par Milan et al. avec un microscope électronique confocal, et a proposé que l'apparition de ce phénomène peut être un mécanisme d'auto-protection des kératinocytes contre l'apoptose induite par uv.

en, une nouvelle étude a découvert que l'exposition aux P2,5 en particulier le composant métallique A1 et Pb, peut provoquer des cellules épithéliales alvéolaires humaines dans le modèle de miR – 4516 et son changement de niveau d'expression du gène cible de RPL37 et ribosomes dysfonctionnement des cellules et autophagie se produit en même temps, en outre, également mis en avant la consommation de RPL37 cellulaire a augmenté l'expression de LC3 – II, ainsi déduire que miR – 4516 / voie de médiation RPL37 peut être les cellules épithéliales alvéolaires d'exposition PM2.5 – induisant autophagy.Deng et al. confirmé par microscope électronique à transmission, PCR et western-blot qui PM2,5 peut induire la production d'ERO et la perte de l'activité antioxydante, conduisant à l'accumulation ERO et la mort cellulaire dans des cellules alvéolaires humaines, et a conclu que PM2,5- traumatisme lié au stress oxydatif joue un rôle important dans l'induction de cellules autophagy.Although il existe peu d'études sur l'effet de PM2,5 sur autophagie la peau et son mécanisme, les résultats de cette étude suggèrent que PM2,5 peut induire l'autophagie dans les kératinocytes humains, qui peut être un mécanisme d'auto-protection des cellules contre les blessures de stress oxydatif et apoptosis.As pour le mir-4516 / voie RPL37 étudié à l'étranger, si elle est également impliquée dans l'apparition de l'autophagie mécanisme de kératinocytes humains reste à déterminer par d'autres études.

 

 

 

 

Figure. 2 LC3Ⅱ / expression ⅰprotein

Figure. 3 Comparaison des niveaux LC3-Ⅱ / Ⅰprotein entre le groupe ex-Perimental et le groupNote de contrôle: Par rapport au groupe témoin,* P <0. 05; Par rapport à Thesame concentration de PM2. 5 des extraits solubles dans l'eau,#P> 0. 05

5.La conclusion d'essai de choc de la peau de PM2,5

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