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El efecto de PM 2.5 en el nivel de la autofagia de los queratinocitos humanos

05/31/2019

  1. La introducción de PM2.5

En el proceso del metabolismo celular, hay la síntesis y degradación de las proteínas y otras macromoléculas, así como la actualización de los orgánulos. Hay dos maneras de degradar sustancias en las células: proteasoma y autophagy.Some estudiosos han propuesto que la autofagia es la respuesta al estrés básica de las células para asegurar su supervivencia en condiciones muy duras, y se puede utilizar como un mecanismo de protección de las células para adaptarse al entorno, prevenir o mitigar la aparición de daño.

PM2.5 se refiere a PM cuyo diámetro aerodinámico es de menos de 2.5 micras. En el presente, un gran número de estudios han demostrado que PM2.5 puede inducir la autofagia en los macrófagos alveolares y cells.In endotelial vascular este estudio, la expresión de marcadores biológicos relacionados con la autofagia se observó mediante el tratamiento de queratinocitos humanos con PM2.5 de diferentes concentraciones y componentes, y se estudió la posible mecanismo de inducción de la autofagia.

 

2.materiales y métodos de ensayo de impacto de la piel de PM2.5

2.1Materiales y reactivos

línea celular epidérmico humano immorphic Ha Ca T se adquirió de centro de China para la preservación de las culturas típicas (Universidad de Wuhan).ubicación PM2.5: 6 metros sobre el suelo, en el techo del instituto de investigación atmosférica, Escuela de Medio Ambiente, Universidad China de Geociencias (Wuhan).El trabajo específico de recogida se completó con la colaboración de la Escuela de Medio Ambiente, Universidad China de Geociencias (Wuhan).proteína relacionada con microtúbulos 1 cadena de luz 3(LC3) anticuerpo policlonal de conejo anti-humana (Señal telefónica, Estados Unidos), de ratón anti-beta-actina (Wuhan Baode co ingeniería biológica., LIMITADO.), kit de ensayo de concentración de proteína BCA, inhibidor de la proteasa y lisado RIPA (Instituto de Biotecnología de Jiangsu Biyuntian);inmunofluorescencia: de cabra anti-Ig de conejo G, HRP de cabra anti-conejo anticuerpo secundario marcado (Wuhan buen presagio co ingeniería biológica., LIMITADO.), microscopio de fluorescencia BX53 (Olimpo, Japón).

2.2Preparación y agrupación de veneno contaminada

Un cierto peso de polvo de PM2.5 se pesó y se añadió a 0.9% solución salina normal para preparar licor madre con una concentración de 1000 mu g / ml, que fue totalmente mezclado y se centrifugó a 13.000 g / min para 30 me. El sobrenadante se toma como la solución de reserva de componentes solubles en agua PM2.5 con una concentración de 1000 mu /mL.By el mismo método, el sedimento fue tomada como una solución de reserva de componentes insolubles PM2.5 con una concentración de 1000 taza de los /mL.The concentraciones preestablecidas de la veneno de colorante son :0.1 micrones / ml, 1 micrones / ml, 10 micrones / ml y 100 células micras /mL.The contaminados con veneno se dividieron en dos grupos: Grupo A (componentes PM2.5 solubles en agua) y el grupo B (componentes PM2.5 solubles en agua).De acuerdo con la concentración, se dividieron en grupo A1 (0.1 mug / mL), grupo A2 (1 mug / mL), grupo A3 (10 mug / mL), grupo A4 (100 mug / mL), grupo B1 (0.1 mug / mL), grupo B2 (1 mug / mL), grupo B3 (10 mug / mL) y el grupo B4 (100 mug / mL).

2.3Cultivo de células y agrupación

células Ha Ca T fueron convencionalmente cultivadas en medio DMEM alto contenido de azúcar que contiene 10% suero bovino fetal, 37℃, 5% CO2, y la incubadora de células con humedad saturada relativa. La solución se cambió para 2 ~ veces 3d, y la cultura pasaje convencional se llevó a cabo. Se seleccionaron las células logarítmicas con buen estado de crecimiento para el experiment.In el grupo experimental, células Ha Ca T con buen crecimiento se trataron respectivamente con PM2.5 de diferentes concentraciones en el grupo A y grupo B y se incubaron en incubadora estéril a 37 ℃ para 24h.Meanwhile, un grupo de control en blanco se estableció.

2.4La expresión de LC3 se detectó por tinción de inmunofluorescencia

Se tomaron células de los grupos experimentales anteriores, y los portaobjetos con células buenas de escalada se empaparon y se lavaron en PBS durante 3 veces en la placa de cultivo, 3min cada vez, fijo con 4% paraformaldehído, y luego a temperatura ambiente durante 15min.PBS que contiene 0.5% Se añadió Triton X-100 y impregnó a temperatura ambiente durante 20min.After tres veces de PBS de inmersión y lavado, que fueron absorbidos seca, y suero de cabra normal se añadió sobre el portaobjetos de vidrio, sellada a temperatura ambiente durante solución de sellado 30min.The fue absorbido por un papel absorbente sin lavar. Cada portaobjetos de vidrio se añadió suficiente LC3 anticuerpo primario diluido(1:500) y se coloca en una caja húmeda, incubaron a 4 ℃ anticuerpo primario overnight.Remove, enjuagar con PBS durante 5 min, repetir 3 times.Goat anti-Ig de conejo G anticuerpo secundario (1:100) se incubó a temperatura ambiente durante 1h.Remove el anticuerpo secundario, enjuagar con PBS durante 3 min, y repetir 3 solución times.DAPI (1:400) estaba manchada, se incubó a temperatura ambiente en oscuridad durante 5 minutos, se enjuagaron con PBS durante 5 min, repite para 4 veces, placas de orificios y extraído.El cerrado de PBS se colocaron en Olympus BX53 microscopio de fluorescencia invertido en el laboratorio para tomar fotos y de formación de imágenes y observar los resultados experimentales.

2.5Western blot se utilizó para detectar los cambios de E / LC3-II

Tome las células experimentales anteriores, 4 ℃ preenfriamiento, PBS enjuagó tres veces, adición de una cantidad adecuada de solución de lisis celular (RIPA) inhibidores de la proteasa y (PMSF), la proporción de acuerdo con la configuración, 1:100 grieta ultrasónica en el hielo para 30 me, aprendido que se trasladó a 1.5 tubo de fluido sobrenadante centrífuga ml, el kit BCA para determinar la concentración de proteínas, SDS-PAGE de separación de electroforesis, transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, cerrado 2 h a temperatura ambiente, la resistencia a LC3 (1:1000) y beta actina (1:200) 4 ℃ durante la noche de incubación, etiquetado HRP dos resistencias (1:50 000) a temperatura ambiente 2 h de incubación,Finalmente, Se repitió la película PVDF fue escaneada por el experimento ECL chemiluminescence.Each tres expresión times.The de beta actina se utilizó como referencia interna, y el valor de escala de grises de la película se analizó por Band Scan.

2.6tratamiento estadístico

Todos los datos fueron analizados con el programa estadístico SPSS20.0. Los datos de medición en este estudio se expresaron como media desviación estándar (X ± s). se utilizó la prueba T para la comparación de la media entre las dos muestras, mientras que se utilizó el análisis de una vía de la varianza para la comparación de la media entre múltiples muestras.

 

3.resultados de las pruebas de impacto de la piel de PM2.5

3.1Los resultados de la tinción de inmunofluorescencia se muestran en la figura 1

En el grupo control, LC3 mostró expresión muy débil y poco, mientras que las células en el grupo experimental tratados con 0.1, 1.0, 10.0 y PM2.5 de diferentes concentraciones y componentes mostró expresión positiva positiva o incluso fuerte después de la tinción de fluorescencia, y la intensidad de fluorescencia roja aumentó con el aumento de la concentración de veneno, y el nivel de la autofagia aumentó significantly.At la misma concentración, no hubo diferencia estadísticamente significativa en la intensidad de fluorescencia roja entre los grupos A y B.

3.2Los resultados de western blot se muestran en la tabla 1 y la figura 2 y 3

Después de 24 horas de las células de intervención PM2.5, LC3-ii niveles de expresión proteica en el grupo A1 ~ A4 y B4 grupo B2 ~ aumentaron con el aumento de la concentración de PM2.5, y fueron significativamente más altos que los del grupo de control (t = 5,38, 11.06, 23.07, 11.84 en el grupo A, 2.77, 4.24, 8.83, 14.88 en el grupo B).PAG < 0.05);Grupo B1 era también más alto que el grupo de control, pero la diferencia no fue estadísticamente significativa (t = 2,77, P = 0.05).A la misma concentración, el nivel de expresión de la proteína de grupo A1 fue mayor que la de grupo B1 (F = 0.42, PAG > 0.05).El nivel de expresión de la proteína de grupo A2 fue mayor que la de grupo B2 (F = 1,85, PAG > 0.05).El nivel de expresión de la proteína de grupo A3 fue mayor que la de grupo B3 (F = 3.96, PAG > 0.05).El nivel de expresión de la proteína de grupo A4 fue mayor que la de B4 grupo (F = 5,19, PAG > 0.05).

 

4.piel discusión prueba de impacto de PM2.5

Autofagia es una vía de degradación de proteínas conservadas en las células, que se refiere al proceso en el que la membrana de aislamiento envuelve citoplasma y / u orgánulos para formar autofagosomas, y luego se fusiona con los lisosomas para formar autofagosomas y degrada en them.Its ocurrencia está mediada por un grupo de la autofagia-relatedproteins (atg), en el que Beclin 1, LC3 beta (o LC3 beta-ii) y los niveles de proteína P62 son indicadores representativos de ocurrencia autofagia y células intensity.When están bajo condiciones de estrés como el hambre, deficiencia nutricional, hipoxia, la reconstrucción estructural durante el desarrollo celular y daño orgánulo, nivel de la autofagia se increase.Studies han demostrado que la autofagia no sólo puede promover la salud corporal, pero también tiene una estrecha relación con los tumores, enfermedades infecciosas, Enfermedades pulmonares, enfermedades neurodegenerativas, cardiomiopatía, envejecimiento y las enfermedades seniles.

Higo. 1 tinción de inmunofluorescencia LC3 ( × 400)

Lengüeta. 1 Los resultados de transferencia Western de LC3Ⅱ / Ⅰ cada grupo ( X ± s)

Un gran número de estudios han encontrado que PM2.5 puede tener efectos tóxicos sobre respiratorio humano, cardiovascular, endocrino y otros systems.As el órgano más grande del cuerpo humano, la piel se expone directamente a la superficie del cuerpo y en contacto con los contaminantes del aire, que es un importante órgano diana para los efectos de las sustancias tóxicas exógenas. sin embargo, hay pocos estudios sobre los efectos de PM2.5 en la piel toxicity.Magnani et al. estudiado la interacción entre las tapas y la ultraestructura de tejidos de la piel con el microscopio electrónico de transmisión. Después de 24 horas de la intervención CAP 100 mg / ml, Se observaron CAPs a aparecer en la capa superior de de reconocimiento structed epidermis humana (HRI ः una), y luego apareció en las células más profundas 48h más tarde, lo que demuestra que PM2.5 puede ser directamente absorbida por el skin.So, cuando queratinocitos epidérmicos humanos están expuestos al ambiente PM2.5, va a inducir la aparición de la autofagia epidérmico?Si es así, ¿cuáles son los efectos de los cambios en los niveles de autofagia en los queratinocitos humanos y qué mecanismos podrían producirse?Para resolver estos problemas, Este estudio utilizó la tinción de inmunofluorescencia y la tecnología de detección blot-oeste ern para analizar cualitativamente los cambios en el número de autofagosomas en los queratinocitos epidérmicos humanos, y cuantitativamente analizar los cambios en la expresión de LC3 proteína relacionada con la autofagia-.

En el presente, hay muchos métodos disponibles para detectar la autofagia, entre los que LC3(cadena de proteína l luz relacionada microtúbulos 3) es la proteína marcadora para la detección de la autofagia. El peso molecular de lc3-i es 18 kD, distribuidos en el peso molecular cytoplasm.The de LC3-II es 16kD. Cuando se produce la autofagia, aumenta la formación autofagosoma, LC3-i se corta específicamente en lc3-ii y se transfiere a autophagosome.Therefore, la conversión de lc3-i a LC3-ii por lo general puede ser detectada para determinar la ocurrencia de análisis cualitativo autophagy.Through de la tinción de inmunofluorescencia, se encontró que la proteína LC3 en el grupo de control mostró expresión muy débil y poco, mientras que las células en el grupo experimental inducida por PM2.5 mostraron expresión positiva positiva o incluso fuerte después de la tinción de fluorescencia, y mostró un aumento en la concentración de dependence.The autor realizó un mayor análisis cuantitativo por el método de transferencia de western y se encontró que la relación proteína / I lc3-ii en el grupo y B2 a1-a4 ~ B4 grupo aumentó con el aumento de la concentración de PM2.5, y fue significativamente mayor que en el grupo de control (PAG < 0.05).A la misma concentración, no hay diferencia significativa en la intensidad de acción de los componentes solubles en agua PM2.5 y resultados experimentales components.These insolubles en agua no sólo confirman que PM2.5 puede inducir la autofagia en queratinocitos epidérmicos humanos, el mantenimiento de la homeostasis de ambiente intracelular por la descomposición de sus propios orgánulos y proteínas, sino también mejorar la actividad de la autofagia de queratinocitos humanos con el aumento de su concentration.Compared con el grupo de control, nivel de proteína LC3-II en el grupo B1 no fue estadísticamente significativa, pero la expresión se aumentó ligeramente, lo que sugiere la autofagia en los queratinocitos después de PM2.5 induction.At mismo tiempo, se observó a través del microscopio de fluorescencia que el número de células en el grupo experimental se redujo significativamente después del tratamiento de veneno PM2.5 a la máxima concentración (100 mug / mL), con la membrana celular incompleta acompañada por la fragmentación nuclear, mal estado celular y tendencia célula a apoptosis.This es similar a las características de la autofagia de queratinocitos humanos irradiados por UV observada por Milan et al. con microscopio electrónico confocal, y propuso que la aparición de este fenómeno puede ser un mecanismo de auto-protección de los queratinocitos contra la apoptosis inducida por UV.

en, un nuevo estudio ha encontrado que en la exposición a PM2.5 especialmente el metal componente A1 y Pb, puede causar que las células epiteliales alveolares humanos en el modelo de miR – 4516 y su gen diana nivel de expresión cambio RPL37 y ribosomas disfunción de las células y la autofagia se produce al mismo tiempo, en adición, También presentado en el consumo RPL37 celular aumentada la expresión de LC3 – II, por lo tanto inferir que el miR – 4516 / vía RPL37 puede ser mediada las células epiteliales alveolares de exposición PM2.5 – inducir autophagy.Deng et al. confirmado a través de microscopio electrónico de transmisión, PCR y Western-blot que PM2.5 puede inducir la producción de ROS y la pérdida de actividad antioxidante, que conduce a la acumulación de ROS y la muerte celular en las células epiteliales alveolares humanos, y concluyó que PM2.5- lesión de estrés oxidativo juega un papel importante en la inducción de células autophagy.Although hay pocos estudios sobre el efecto de la PM 2.5 en la autofagia piel y su mecanismo, Los resultados de este estudio sugieren que las PM2.5 puede inducir la autofagia en los queratinocitos humanos, que puede ser un mecanismo de auto-protección de las células contra el daño estrés oxidativo y apoptosis.As para la vía / RPL37 mir-4516 estudiado en el extranjero, si también está implicado en la aparición de mecanismo de autofagia de queratinocitos humanos queda por determinar por otros estudios.

 

 

 

 

Higo. 2 LC3Ⅱ / expresión ⅰprotein

Higo. 3 Comparación de los niveles LC3-Ⅱ / Ⅰprotein entre el grupo de ex-perimental y el control de groupNote: En comparación con el grupo control,* P <0. 05; En comparación con thesame concentración de PM2. 5 extractos solubles en agua,#P> 0. 05

5.piel conclusión de la prueba de impacto de PM2.5

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